作者：王超杰

山西农业大学动物医学学院-动物药物工程课题组

流行性感冒是由A型流感病毒引起的一种人兽共患传染病，主要是禽流感病毒（AIV）引起的。先天免疫是机体先天具有的正常的生理防御功能，能够对各种不同的病原微生物和异物入侵做出相应的免疫应答。禽流感病毒（AIV）会引起零星爆发甚至大流行，是因为病毒能够逃避宿主的免疫反应，而且治疗手段有限。

近日，中国医学科学院基础医学研究所蒋澄宇研究员团队牵头在中国免疫学会会刊Cellular & Molecular Immunology（IF= 22.096）发表了题为Avian influenza viruses suppress innate immunity by inducing trans-transcriptional readthrough via SSU72的研究论文。该成果为进一步了解流感病毒感染宿主、以及宿主免疫系统的抵抗机制提供了基础，为流感病毒的预防提供新的思路。

当病毒感染人体细胞以后，病毒会将病毒的遗传物质输入到人体细胞内，病毒的遗传物质在细胞内利用细胞器进行自我复制，在这个过程当中，会干扰细胞的正常生命活动，造成细胞内的功能紊乱，有可能会导致细胞的裂解死亡。在本研究中，作者通过对感染H1N1、H5N1和H7N9病毒的人A549肺癌细胞进行RNA序列分析，对多种感染病毒细胞系进行细胞活力分析，发现甲型流感病毒感染引起细胞转录通读（transcriptional readthrough, TRT）增加，TRT与甲型流感病毒感染细胞的活力呈负相关。

图3 在A549、HEK293、HEK293T、HPF-a、H1650和HeLa细胞中使用MTS测定H5N1流感病毒感染后24小时的细胞活力

为了确定哪些基因最受AIV感染的影响，作者计算了TRT水平与顺式和反式基因表达水平之间的相关性，发现反式基因表达与细胞感染的相关性更强，这说明TRT可能特异性调节感染细胞互补链上基因的表达。

图4 在H5N1/H7N9/H1N1感染A549细胞后的不同时间，TRT影响基因的反式-TRT/顺式-TRT模式之间的上调和下调TRT区域表达水平的Spearman秩线性相关分析

作者在H5N1和H7N9感染细胞中发现，反式TRT影响的基因增加了。对反式TRT基因数量和细胞活力与病毒复制相关性分析发现，TRT与病毒的致死性相关。

图5 H5N1/H7N9感染A549细胞后不同时间的反式TRT影响基因数量

图6 细胞活力与反式TRT影响基因数量的相关性分析

图7 病毒复制与反式TRT影响基因数量的相关性分析

通过对反式TRT影响的基因的功能分析发现，反式转录相关基因可能与H5N1病毒感染相关的高致死率有关，并有助于抵抗宿主先天免疫。

图8 H5N1感染的A549细胞中反式TRT影响基因的功能通路富集分析

图9 H7N9感染的A549细胞中反式TRT影响基因的功能通路富集分析

然后作者对GLS和IL23A中转录终止点位（TTS）下游的TRT区域（对应着STAT1和STAT2中的反式TRT位置）使用探针进行荧光原位杂交，研究H1N1和H5N1感染细胞中STAT1和STAT2表达水平，

图10、11 A549细胞经AF/H1N1/H5N1/H7N9处理后12h，GLS基因、GLS的反式TRT区和STAT1基因的RNA序列覆盖水平，以及IL23A基因、IL23A的反式TRT区和STAT2基因的RNA序列覆盖水平

这些数据表明，TRT通过反式TRT影响互补链上先天免疫基因的表达，尤其是STAT1和STAT2。为了进一步证明TRT对STAT1/2的抑制作用，作者使用CRISPRi消除了A549细胞中GLS和IL23A中的TRT，然后研究STAT1和STAT2表达。结果表明，GLS和IL23A的TRT抑制互补链上抗病毒基因STAT1和STAT2的转录。

在研究TRT潜在机制的过程中，作者发现H5N1感染后SSU72蛋白表达显著下降，但在H1N1感染后没有下降，而TRT发生在SSU72蛋白降解之前，这表明SSU72可能与TRT有关。于是作者敲除了A549细胞的SSU72表达基因，在H1N1和H5N1感染后，敲除了SSU72基因的A549细胞表现出了较低的生存能力，较高的GLS和IL23A TRT水平和较低的STAT1/2 mRNA水平，这说明SSU72是AIV感染期间TRT的关键调节因子。

为了进一步探讨SSU72对TRT调节的机制，作者在HEK293T细胞中过度表达了10个H5N1基因，并进行RNA序列分析，发现过度表达H5N1 NS1蛋白的细胞具有更高的TRT水平和更低的SSU72表达水平。通过免疫共沉淀试验和共焦显微镜成像显示，H5N1 NS1蛋白直接与人SSU72蛋白结合，导致其表达减少，最终诱导TRT并抑制STAT1/2 mRNA表达。

为了进一步阐明SSU72在甲型流感病毒感染中的作用，作者制备了肺部SSU72过表达的转基因小鼠，并用H5N1感染。小鼠肺组织的RNA进行序列分析结果表明SSU72转基因小鼠的TRT基因数量小于对照小鼠，并且STAT1和STAT2的肺表达水平较高，肺损伤和水肿较轻，病毒滴度较低，存活率较高。这些结果表明SSU72的过度表达可以抑制小鼠肺组织中的TRT。最后，作者采集了H7N9、H5N6、H1N1、肺炎患者（无流感病毒感染）和健康人的血样，分离外周血单个核细胞（PBMC）进行RNA序列分析，验证了实验室结果。

在本研究中，作者发现RNA聚合酶II C端的磷酸酶SSU72是TTS的一个基因环调节器，在TRT调节中起着至关重要的作用。AIV病毒通过NS1蛋白直接与SSU72结合减少其表达，诱导的反式TRT抑制抗病毒基因STAT1和STAT2的表达，这使得病毒能够逃避宿主的抗病毒免疫反应，抑制先天免疫系统。但还需要进一步研究为什么TRT主要在反式而非顺式中起作用，探索其他受反式TRT影响，与先天免疫反应相关的基因。这一AIV抑制先天免疫机制的揭示对未来禽流感病毒的预防和治疗有着重大意义。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41423-022-00843-8